去內(nèi)毒素試劑盒

使用說明書

僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!

第1版（2016年04月修訂）

關(guān)聯(lián)信息

細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的特有成份，它是一種外源性致熱原，可通過激活巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等引起炎性介質(zhì)的釋放，導(dǎo)致機(jī)體的損傷，嚴(yán)重者可引發(fā)膿毒性休克甚至死亡。而內(nèi)毒素又是生物制品的重要污染物，所以，對(duì)于直接進(jìn)入人體或者動(dòng)物體內(nèi)的生物制品、藥品都必須嚴(yán)格控制其內(nèi)毒素含量。因此，內(nèi)毒素的去除對(duì)于一些生物制品的下游純化處理來說就顯得非常重要。

原理

多粘菌素（Polymyxin）是由多粘芽胞桿菌（Bacilluspolymyxa）產(chǎn)生的一組多肽類抗生素。其中，多粘菌素B（PMB）能拮抗細(xì)菌內(nèi)毒素，雖然他們的結(jié)合機(jī)理還存在很多爭議，但是它們之間是通過靜電作用，離子作用和親水作用等多種因素共同作用的結(jié)果是大家普遍接受的事實(shí)。本試劑盒基于這一原理利用親和樹脂中的多粘菌素B與內(nèi)毒素特異性的結(jié)合去除樣品中的內(nèi)毒素。親和樹脂的主要特性如下表：

規(guī)格	1.5 ml 預(yù)裝柱
結(jié)合能力	≥2,000,000 EU/ml 樹脂
配基	修飾的多粘菌素 B (PMB)
pH范圍	pH 5-10
基質(zhì)	4% 交聯(lián)的瓊脂糖凝膠
顆粒大小	90 μm
保存溫度	2°C-8°C
使用壽命	18 個(gè)月
平衡緩沖液	磷酸鹽緩沖液，pH 8.0
離子條件	0.1-0.5 M NaCl
可耐受試劑	20% DMSO,，20% 乙醇，20% 甘油，1 M 尿素，300 mM 咪唑， 0.05% 吐溫-20， 10 mM DTT 等

產(chǎn)品組分

名稱	規(guī)格
親和樹脂	1.5 ml 預(yù)裝柱
再生緩沖液	250 ml
平衡緩沖液	250 ml
流速控制器	1 個(gè)
無熱原接收管	1 包 （3 支/包）
無熱原槍頭（1 ml）	2 包（6 支/包）
說明書	1 份

*親和樹脂重復(fù)使用5次不改變結(jié)合效率

還需準(zhǔn)備的設(shè)備和試劑

1. 純化柱支架
2. 0.1M NaOH和0.1M HCl，用于調(diào)節(jié)樣品PH值
3. 氯化鈉和乙醇

儲(chǔ)存及有效期

4℃保存，有效期一年。

適用范圍

蛋白，多肽，抗體，多糖等溶液中內(nèi)毒素的去除，樣品最終的內(nèi)毒素水平可低于0.1 EU/ml。

操作步驟

1. 樣品處理：結(jié)合內(nèi)毒素的pH范圍為5-10，pH范圍7-8進(jìn)行純化最佳。樣品在0.15-0.5M NaCl的條件可以明顯增強(qiáng)特異性吸附并降低非特異性吸附。純化之前可以使用無內(nèi)毒素的5M氯化鈉、0.1 M NaOH或0.1M HCl來調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度或PH值。
2. 活化樹脂：垂直裝配好預(yù)裝柱，去除頂部蓋子，打開流速控制器，使保護(hù)液流干。加入5ml再生緩沖液，調(diào)節(jié)流速控制器，保持流速在0.25ml/min（或10滴/min），待再生緩沖液流干后再加入5ml再生緩沖液，重復(fù)操作2次，以確保體系中無熱源（即內(nèi)毒素）存在。（注意：第一次使用也必須進(jìn)行本步驟。）
3. 平衡樹脂：加入6ml的平衡緩沖液，調(diào)節(jié)流速控制器，保持流速在0.5ml/min，流干平衡緩沖液，再按此操作重復(fù)2次。
4. 內(nèi)毒素去除：將流速控制器關(guān)閉，使用無熱源槍頭加入樣品，打開控制器，控制流速不高于0.25ml/min，流出液體積達(dá)到1.5ml后，使用無熱源接收管收集樣品。待樣品流干后，再加入1.5ml-3.0ml的平衡緩沖液淋洗，收集淋洗液。檢測樣品濃度及所含內(nèi)毒素水平。（如果流出樣品內(nèi)毒素水平未能達(dá)到預(yù)期值，需要將預(yù)裝柱按照步驟2重新再生，然后上樣純化。）
5. 柱保存：預(yù)裝柱用完后，先用10ml平衡緩沖液平衡柱，待平衡液流干，加入1.5ml的再生緩沖液（含0.02%的疊氮化鈉），2℃‐8℃保存。 

注意事項(xiàng)

1. 在使用本產(chǎn)品過程，請嚴(yán)格控制操作環(huán)境，防止外來內(nèi)毒素污染純化過的樣品。
2. 試劑盒內(nèi)物內(nèi)毒素槍頭盒收集管開封后，一次性用完。
3. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

問題及解決方法

問題	問題原因	解決方法
去除效率低	樣品的pH值過高或者過低，不在最適范圍	調(diào)節(jié)pH至7-8
	樣品和親和樹脂孵育時(shí)間太短	降低樣品的流速，或者通過低溫孵育來解決
	去除或檢測系統(tǒng)受到外來因素污染	使用無熱源的實(shí)驗(yàn)儀器，保證體系不受污染
	內(nèi)毒素與目的蛋白結(jié)合太牢固	1. 優(yōu)化樣品的pH，使它們解離  2. 增加接觸樣品與親和樹脂的時(shí)間
樣品損失高	樣品通過非特異性作用結(jié)合在親和樹脂上	增加樣品和平衡緩沖液中NaCl的含量
	目的蛋白與內(nèi)毒素結(jié)合牢固	1. 優(yōu)化樣品的pH，使內(nèi)毒素解離出來 2. 增加接觸樣品與親和樹脂的時(shí)間
樣品被污染	同一根柱子處理不同的樣品	盡量避免使用同一個(gè)預(yù)裝柱處理不同樣品。 如果無法避免，可以在處理一個(gè)樣品之后，用10-20 ml 2M NaCl淋洗樹脂，然后再處理另外一 種樣品
再生緩沖液出現(xiàn)渾濁	當(dāng)再生緩沖液達(dá)到室溫時(shí)將會(huì)出現(xiàn)渾濁	使用之前在冰上冷卻再生緩沖液或者在4℃條件下進(jìn)行再生