免疫組化輔助試劑包（兩步法）

使用說明書

僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!

第1版（2016年04月修訂）

[產(chǎn)品信息]

通過辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（抗抗體）與結(jié)合在組織片上的一抗特異性結(jié)合形成免疫復(fù)合物。位于聚合物上HRP會(huì)催化底物H₂O₂與DAB反應(yīng)，最終形成棕褐色不溶性色原，特異性的將免疫原在組織和細(xì)胞中標(biāo)定出來，通過顯微鏡觀察確定免疫原的最終位點(diǎn)。

[試劑組分] 

編號(hào)	成分
1	內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑工作液	3mL	6mL	18mL	55mL	110mL
2	HRP標(biāo)記抗IgG聚合物（可選）	3mL	6mL	18mL	55mL	110mL
3	封閉血清工作液	3mL	6mL	18mL	55mL	110mL
4	蘇木素染液	3mL	6mL	18mL	55mL	110mL
5	枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液(20×)	10mL	20mL	60mL	200mL	400mL
6	顯色劑 (1×)	3mL	6mL	18mL	55mL	110mL
7	DAB顯色液 (50×)	60uL	120uL	360uL	1.1mL	2.2mL

[備選指標(biāo)]

編號(hào)	名稱	編號(hào)	名稱
IS085-1	HRP標(biāo)記兔抗人IgG聚合物	IS085-9	HRP標(biāo)記兔抗犬IgG聚合物
IS085-2	HRP標(biāo)記兔抗小鼠IgG聚合物	IS085-10	HRP標(biāo)記兔抗綿羊IgG聚合物
IS085-3	HRP標(biāo)記兔抗大鼠IgG聚合物	IS085-11	HRP標(biāo)記兔抗貓IgG聚合物
IS085-4	HRP標(biāo)記兔抗雞IgG聚合物	IS085-12	HRP標(biāo)記兔抗馬IgG聚合物
IS085-5	HRP標(biāo)記兔抗豬IgG聚合物	IS085-13	HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG聚合物
IS085-6	HRP標(biāo)記兔抗牛IgG聚合物	IS085-14	HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG聚合物
IS085-7	HRP標(biāo)記兔抗山羊IgG聚合物	IS085-15	HRP標(biāo)記豚鼠抗兔IgG聚合物
IS085-8	HRP標(biāo)記兔抗豚鼠IgG聚合物

[適用范圍]

本產(chǎn)品僅用于免疫組化實(shí)驗(yàn)，適用于手工和機(jī)器大批量操作。本試劑僅對10%中性緩沖福爾馬林固定石蠟包埋的組織進(jìn)行了驗(yàn)證，不作其他用途。

[儲(chǔ)存及有效期]

2～8℃避光保存，不得凍存；產(chǎn)品有效期為6個(gè)月。

[實(shí)驗(yàn)操作]

1、完成IHC實(shí)驗(yàn)還要的設(shè)備和試劑

   a)、移液器、恒溫箱、修復(fù)儀、免疫組化筆、計(jì)時(shí)器、孵育盒、染色架、蓋玻片、光學(xué)顯微鏡、洗瓶。

   b)、DAB顯色液：利用顯色劑稀釋DAB顯色液到工作液濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

   c)、pH 6.0，0.01M枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液：利用雙蒸水稀釋到工作液濃度使用。

2、實(shí)驗(yàn)步驟

（1）烘片：鉛筆標(biāo)記用于區(qū)分石蠟切片，65℃，1-2h。

（2）脫蠟至水：烘片結(jié)束，石蠟切片依次于二甲苯I 30min，二甲苯II 30min，100%、100%、95%、80%、70%的乙醇中各10min，再放入純水里10min。

（3）抗原修復(fù)。高溫高壓法和微波法自選。

      高溫高壓法：壓力鍋中加入pH 6.0 ，0.01M枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液約1000ml，切片插入塑料架上，放入壓力鍋，蓋上鍋蓋（此時(shí)不扣上壓力閥）1600W預(yù)熱至沸騰，扣上壓力閥1300W，待高壓鍋閥門噴氣開始計(jì)時(shí)，修復(fù)時(shí)間為2分鐘。

      微波法：取一定量pH 6.0 ，0.01M枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液，加入微波盒中，微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，微波低火處理3分鐘，放置8分鐘后低火3分鐘，取出微波盒流水自然泠卻，從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS沖洗3分鐘×3次。

（4）阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。加入適量的內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10分鐘；PBS緩沖液沖洗3分鐘×3次。

（5）非特異性位點(diǎn)的封閉：甩去殘夜，滴加封閉血清工作液覆蓋切片，約200ul/片，室溫孵育20min。

（6）滴加一抗。根據(jù)組織大小，滴加100μL或適量的一抗，37℃孵育60分鐘；PBS緩沖液沖洗3分鐘×3次。

（7）根據(jù)實(shí)驗(yàn)物種的差異選擇合適的HRP標(biāo)記抗IgG聚合物，滴加100μL或適量的HRP標(biāo)記抗IgG聚合物，37℃孵育30分鐘；PBS緩沖液沖洗3分鐘×3次。

（8）顯色。加入適量新鮮配制的DAB，室溫孵育30秒-5分鐘，根據(jù)顯微鏡下著色情況終止反應(yīng)。

（9）復(fù)染。自來水沖洗，蘇木素染色液孵育2分鐘；滴加1%鹽酸酒精分色1秒、PBS沖洗返藍(lán)。

（10）脫水、透明、封片。

（11）顯微鏡觀察，拍照。

[注意事項(xiàng)]

1、在每一次染色過程中，必須有空白對照和陰性對照實(shí)驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行。

2、如果陽性組織對照不能顯示適當(dāng)?shù)年栃匀旧瑧?yīng)判定該批次樣本的檢測結(jié)果無效。

3、若HRP標(biāo)記IgG聚合物孵育溫度過高或孵育時(shí)間過長，可能導(dǎo)致染色過強(qiáng)及背景染色。

4、紅細(xì)胞和細(xì)胞色素 C可能會(huì)造成假陽性結(jié)果。

5、脫蠟不徹底，容易影響染色效果，建議免疫組化切片脫蠟與常規(guī)HE脫蠟分開。

6、為防止可能出現(xiàn)的假陽性、假陰性結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)過程中需設(shè)置陽性與陰性對照。

7、實(shí)驗(yàn)中滴加試劑時(shí)，過多的PBS緩沖液會(huì)導(dǎo)致試劑被稀釋，將引起染色強(qiáng)度變?nèi)?，因此，滴加試劑前?yīng)除去多余的緩沖液。

8、在實(shí)驗(yàn)操作過程中，請穿戴好手套、眼鏡和實(shí)驗(yàn)服，以及依照相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)流程，做好防護(hù)措施。