一氧化氮測(cè)定試劑盒 (A013-2)
使用說(shuō)明書(shū)
僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!
第1版（2016年04月修訂）
[預(yù)期應(yīng)用]
本試劑盒可測(cè)血清、血漿、組織樣本和其它生物液體中N0含量。
一氧化氮NO (即血管內(nèi)皮舒張因子)，在生物體內(nèi)作為種反應(yīng)性極強(qiáng)的自由基，兼有第二信使和神經(jīng)遞質(zhì)作用，同時(shí)又是一種效應(yīng)分子，在體內(nèi)縣有廣泛的生理作用，如松弛血管平滑肌、抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)腦血流、介導(dǎo)細(xì)胞毒效應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)、參與學(xué)習(xí)和記憶、動(dòng)脈粥樣硬化等作用。NO產(chǎn)生異常與某些疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。因此，近年來(lái)對(duì)NO的研究越來(lái)越受到廣大科學(xué)工作者的重視。
[試劑盒內(nèi)容]
試劑 | 數(shù)量（96T） | 試劑 | 數(shù)量（96T） |
Reagent 1 | 1×20ml | Reagent 5 | 1×3ml |
Reagent 2 | 1×10ml | 2mmol/L Sodium nitrite 標(biāo)準(zhǔn)品 | 1×1ml |
Reagent 3 | 1×10ml | 說(shuō)明書(shū) | 1 |
Reagent 4 | 1×3ml |
臨測(cè)定前，用雙蒸餾水將2mmol/L標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至20μmol/L。
[試劑盒的儲(chǔ)存及有效期]
1. Reagent 1：4oC可保存6個(gè)月。
1. Reagent 2：4oC可保存6個(gè)月。
2. Reagent 3：4oC避光可保存6個(gè)月。
3. Reagent 4：4oC避光可保存6個(gè)月。
4. Reagent 5：4oC保存6個(gè)月。
5. 2mmol/LSodium nitrite標(biāo)準(zhǔn)品：4oC保存6個(gè)月。
[試劑準(zhǔn)備]
1. 顯影劑：R3:R4:R5= 2.5:1:1，臨用前制備，在4oC存儲(chǔ)，當(dāng)顏色加深時(shí)不能使用。
2. 標(biāo)準(zhǔn)：用蒸餾水稀釋2 mmol/L亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)，分別為1:39、1:79、1:99、1:159、1:319、1:639，制備0.05mmol/L、0.025mmol/L、0.02mmol/L、0.0125mmol/L、0.00 625mmol/L、0.00 3125mmol/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[標(biāo)本處理]
1. 血清
取血清直接用于實(shí)驗(yàn)。
2. 組織樣本
動(dòng)物組織：取適量組織樣本，稱重，按比例加入生理鹽水制備組織勻漿（質(zhì)量體積比=1：9，例如900μl生理鹽水中加入100μg組織），2500～3000 0rp/min離心10分鐘，取上清液用于實(shí)驗(yàn)。
植物組織：取適量組織樣本，稱重，按比例加入 0.1mol/L PBS（pH7~7.4）制備組織勻漿（質(zhì)量體積比=1：9，例如900μl0.1mol/L PBS（ pH7~7.4）中加入100μg組織），4000rpm/min離心10分鐘，取上清液用于實(shí)驗(yàn)。
細(xì)胞樣本：用六孔板培養(yǎng)細(xì)胞，若要測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中的總蛋白含量，則應(yīng)直接檢測(cè)；若要確定細(xì)胞的總蛋白含量，則用胰蛋白酶消化細(xì)胞（或直接刮取細(xì)胞），收集細(xì)胞和液體于試管內(nèi)，1000～3000 rpm/min離心5分鐘，棄上清液。在沉淀中加入1ml生理鹽水，混勻（洗脫胰蛋白酶原和培養(yǎng)液），1000～3000 rpm/min 離心5分鐘，棄上清液并保存沉淀細(xì)胞，加入0.2～0.3mL生理鹽水制備勻漿液（有以下4種勻漿方法）：a. 細(xì)胞裂解液；b. 超聲處理；c. 搖晃； d玻璃勻漿器，每次研磨5～10秒，研磨3～4次，每次間隔20秒，取勻漿用于實(shí)驗(yàn)。
注：取樣前搖勻。
[操作步驟]
1. 標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)處理
用蒸餾水稀釋2 mmol/L Sodium nitrite 標(biāo)準(zhǔn)，稀釋倍數(shù)分別為1:39、1:79、1:99、1:159、1:319、1:639，制備0.05mmol/L、0.025mmol/L、0.02mmol/L、0.0125mmol/L、0.00625mmol/L、0.003125mmol/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。
2. 樣本預(yù)處理
血清(血漿):
取100μl 血清(血漿)， 加200μl Reagent 1 , 混勻，加100μl Reagent 2,漩渦充分混勻后靜置10分鐘，3500~4000rpm/min離心15分鐘，取上清液160μl 用于實(shí)驗(yàn)。
組織勻漿：取300μl 10%勻漿上清液，加200μl Reagent 1 , 混勻，加100μl Reagent 2, 漩渦充分混勻后靜置10分鐘，3500~4000rpm/min離心15分鐘，取上清液160μl 用于實(shí)驗(yàn)。
3. 操作表
| 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 樣本管 | ||
| 雙蒸水 (ml) | 0.16 | |||
| 2 mmol/L Sodium nitrite 標(biāo)準(zhǔn)品（ml） | 0.16 | |||
| 上清液（ml） | 0.16 | |||
| 顯影劑（ml） | 0.08 | 0.08 | 0.08 | |
| 混勻，靜置15min，在550nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔O.D.值。 | ||||
[實(shí)驗(yàn)原理]
NO本身半衰期極短，血液中的NO主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、血小板、巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生以亞硝酸鹽及硝酸鹽的形式存在，通過(guò)其濃度可以間接測(cè)定NO濃度。
[說(shuō)明]
1. 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
2. 上清液需澄清，若混濁，建議再次離心。
3. 血清樣本出現(xiàn)溶血和渾濁會(huì)影響結(jié)果。
4. 血液和組織在4～5℃可保存3天，溫度越低，保存時(shí)間越長(zhǎng)。在-20℃下可保存1～2個(gè)月。
5. 請(qǐng)參考血清（血漿）檢測(cè)培養(yǎng)液并計(jì)算。
6. 細(xì)胞培養(yǎng)上清樣本測(cè)算請(qǐng)參考血清血漿樣本。
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